嗜酒如命是天生如此吗？ ——inscopix神经元超微钙成像系统应用

嗜酒如命是天生如此吗？

——inscopix神经元超微钙成像系统应用

刚过去的这个春节可谓几十年来最不寻常的一个，一场突如其来的疫情打乱了我们所有的计划。在大年初一的那天开始，各地都进入了封闭状态，一切计划中的欢庆都未曾开始。闹区依然不见了，往年春节时的大吃大喝觥筹交错的场景消失了。然而，这个春节因为醉酒而发生的事故必然创历史最低。以往春节里，迎来送往必不可少，总会有人喝多了酒记不起回家的路。

据统计，超过80％的成年人在其一生中会不同程度的摄取酒精，其中有不到30％的人会发展为酒精使用障碍（alcohol use disorder，AUD）。

那么，酒精为什么会在个体之间产生如此不同的结果？酗酒是天生的吗？还是后天习惯养成？

在小鼠身上做的实验有助于理解这个事情。

讲解之前，我们先了解一个概念：强迫性饮酒，就是在体会到饮酒的痛苦之后依然喜欢酗酒，这是酒精使用障碍的一种特征。对绝大多数的人来说，酒都不是一种比果汁更美味的存在，所以酒精使用障碍是一部分人嗜酒的原因。

研究人员在小鼠身上再现人类酗酒并体验酗酒痛苦的过程，并让体会到酗酒痛苦后的小鼠再次饮酒，观察小鼠是否愿意在知晓痛苦后仍义无反顾地饮酒。

研究人员将小鼠分成3组，每组小鼠先期经过3天的只提供酒（15%）的训练（第1-3天）；

接着从第4天开始，在酒里逐步添加更多剂量的奎宁，持续2天（第4-5天），奎宁作为一种苦味剂，使小鼠感受到饮酒的痛苦；

接着进行的就是14天的无限制提供饮酒和水，模拟酗酒行为，3个小组分别每天有2，4，6个小时进行无限制饮用时间（第6-19天）；

酗酒训练结束后，恢复只提供饮酒，持续3天（第20-22天）；

最后4天，提供饮酒+奎宁（第23-26天）（图1A）。

研究人员发现，不同小鼠个体在实验中表现出了较大的差异（图1B）。

根据小鼠在酗酒期的饮酒行为，他们将小鼠分为了3种类型，（1）一直饮酒较少，与酒中的奎宁浓度无关，称作低饮酒鼠。（2）饮酒较多，但对奎宁酒的处理较敏感，称作高饮酒鼠。（3）饮酒较多，并且对奎宁酒的处理惰性较强，依然保持高饮酒量，称作酗酒鼠（图1C）。

酗酒训练过后，低饮酒鼠的酒精摄入量有所减少；高饮酒鼠在酗酒训练后对奎宁酒的敏感性有所增加；酗酒训练前，酗酒鼠表现出对奎宁酒的高耐受力，酗酒训练后，这种耐受力更加有所增强。（图1D-H）

（图1）

根据以往研究，内侧前额叶皮层（mPFC）在介导包括强迫性成瘾在内的病理性嗜药行为中起着至关重要的作用，嗜酒行为也算其中一种。而既往损伤或酒精引起的PFC功能变化均可导致出现适应不良的行为，也会导致强迫性饮酒的出现。而导水管周围灰质（PAG）参与对厌恶事件的反应，包括戒酒期间的负面情感状态和痛觉过敏。从mPFC投射到背侧PAG的神经元（mPFC-dPAG）编码对厌恶事件做出的行为。而mPFC-dPAG神经元的功能缺陷可能会破坏这一过程，从而导致强迫性饮酒。

为了知晓这些不同类型鼠在饮酒实验中的表现是不是有这种神经结构上的先天因素，接下来的实验里，在饮酒实验前对小鼠的大脑进行了植入式的神经钙活动成像。在实验全程进行信号记录观察，所用的仪器是由格罗贝尔生物科技引进中国并du家代理的inscopix公司的nVista微型显微成像设备。这个设备可以在小鼠进行行为学实验及自由活动期间对其大脑内的神经钙活动信号进行实时观察及记录。整个显微镜埋植在小鼠头骨上，由一根自聚焦透镜深入脑内部，根据透镜长度可以进行表面大脑皮层的观察和深部脑区如海马，纹状体等的观察。透镜有0.5mm、0.6mm、1mm直径的选择，整个透镜重约2克，小鼠完全可以在清醒状态下进行各种自由行为活动。根据调整内部液体透镜的电子对焦，其焦平面变化可变范围达300微米，借助钙指示病毒表达的绿色荧光蛋白可以清晰显示神经元胞体、轴突的脉冲式钙活动，反映神经环路中的具体实时活动。

研究人员将Cre依赖性表达GCaMP6m的顺行追踪病毒注射到mPFC中，将携带Cre重组酶的逆行追踪病毒注射到dPAG中（图2A），通过显微镜可以观察到神经元成像（图2B）并可以提取神经元活动（图2C）。研究人员在实验酗酒训练前的阶段从记录到的钙信号中找出了352个神经元活动，并对其进行了聚类分析（图2D-E）。

（图2）

整个实验完成后，研究人员发现，在第1天饮酒中，酗酒鼠比低饮酒鼠脑中有更多的mPFC-dPAG神经元表现出抑制反应，饮酒期间，低饮酒鼠比酗酒鼠的mPFC-dPAG神经元有更强的兴奋性（图2F，G，H）。此时各类型小鼠尚未表现出饮酒行为上的差异。但这种神经元兴奋上的差别已显示出与2周酗酒实验之后的饮酒行为有相关性（图2I，J，K）。

（图2）

那改变这种神经元活动是不是会对小鼠之后的饮酒行为产生影响。

研究人员在小鼠大脑双边的mPFC神经元均表达了盐视紫红质（NpHR），并在双边dPAG植入了光纤，以进行神经元的光遗传抑制。在小鼠饮酒或水的过程中，嘴舔到瓶嘴即触发光抑制。对照组则没有光遗传抑制。酒瓶里则添加了更高浓度的奎宁，以模拟最gao程度的饮酒惩罚。

实验发现，有光遗传抑制的小鼠饮酒比对照组增加了两倍以上，但是水的消耗并没有受到影响。而不会影响水消耗（图3A-G）。

（图3）

然后实验增加了脚下电击设置，小鼠每次舔舐酒瓶嘴都会触发电击，这种情况下，光遗传抑制依然可以再次促进饮酒行为（图3H-I）。

（图3）

为了确定mPFC-dPAG神经元活性的光抑制是否通过增加酒精的效果或降低对惩罚的敏感来促进饮酒行为，研究人员对每项成分进行了单独实验，发现在没有惩罚情况下，光抑制不会促进酒消耗（图3J-K）。

（图3）

在类似的痛苦体验实验中，在将鼠尾浸入50℃水中，光抑制可以使小鼠撤出尾巴前的忍受时间变长。一方面奎宁对机体并不会有明显的痛觉刺激，另一方面这一神经环路对有害刺激又有类似反应，因此，光遗传抑制mPFC-dPAG神经元活性其实是改变了小鼠对厌恶事件的反应。

为了测试激活这一神经环路对饮酒的影响，研究人员在mPFC-dPAG神经元中双向表达了ChR2，一种光激活蛋白，并在mPFC上植入了光纤。并在分析时避免对另一侧的脑区造成影响，以保证实验鼠正常的运动和情绪反应（mPFC控制着相应功能）。这次实验中，瓶嘴的舔舐触发光遗传激活。实验过程中，随着光刺激的功率不断增加，酒精舔舐不断减少，而饮水则没有变化，这一神经环路的光遗传激活作用类同大脑奖赏反馈中的惩罚，这是成瘾行为的标志（图4）。

（图4）

研究表明，在小鼠身上，饮酒行为与其先天的神经表型是有明显的相关性的，对厌恶通路的抑制或者缺失使得小鼠更愿意尝试具有痛苦体验的事物。同样的原理在人身上也极有可能以类似的形式存在着。从实验中可以看出，饮酒的痛苦是真实的，即便是对于酗酒小鼠，在酗酒训练后，对其也是种强烈的刺激，并且会不断增加阈值，这种刺激虽然于它在神经层面是一种痛苦免疫的情形，但也只是降低了痛苦的感知，对机体其他方面的损害却是没有丝毫减少的。

对于人来说，为了自己和家人的健康，酒还是少饮为妙，因为可能在你不知不觉中，你的大脑就会对它索取超过你身体可以承受的多。

参考文献：

Siciliano C A , Noamany H , Chang C J , et al. A cortical-brainstem circuit predicts and governs compulsive alcohol drinking[J]. Science, 366.